Ενότητα Εργασίας 4. Εκτίμησης της επίδρασης συνθηκών εκτροφής στην καταπόνηση (Stress)
Στόχοι
1. Ανάπτυξη νέων δεικτών εκτίμησης της καταπόνησης,
2. Διερεύνηση του μηχανισμού απόκρισης στην καταπόνηση του κρανιού,
3. Εκτίμηση του βαθμού καταπόνησης στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής,
4. Βελτιστοποίηση των συνθηκών εκτροφής για ορθή μεταχείριση (welfare) του κρανιού.
Εργασία 4.1. Ανάπτυξη νέων δεικτών εκτίμησης της καταπόνησης
Ο σκοπός αυτής της ενότητας είναι (α) η ανάπτυξη μη επεμβατικών δεικτών εκτίμησης του stress και (β) η ανάπτυξη μοριακών δεικτών εκτίμησης του χρόνιου stress. Στην κατεύθυνση αυτή θα αξιολογηθεί ο προσδιορισμός της κορτιζόλης στο νερό των δεξαμενών προπάχυνσης και μεταφοράς γόνου σαν μη επεμβατικός δείκτης εκτίμησης του stress στο συγκεκριμένο είδος. Επίσης θα αναπτυχθούν μοριακά εργαλεία για τη μελέτη της έκφρασης συγκεκριμέων γονιδίων που εμπλέκονται στον μηχανισμό χρόνιου stress, όπως HSP90, HSP70, Glucocorticoid Receptor, Mineralcorticoid Receptor.
Εργασία 4.2. Διερεύνηση του μηχανισμού καταπόνησης
Ομάδες κρανιού από δυο διαφορετικές οντογενετικές φάσεις (γόνος και ενήλικα άτομα) θα εκτεθούν σε οξύ stress (κυνήγι με απόχη μέσα στη δεξαμενή για 3-5 min και έκθεση στον αέρα για περίπου 1 min) και στη συνέχεια θα μεταφερθούν σε διαφορετικές δεξαμενές (5 άτομα/δεξαμενή) και θα μελετεθεί η φυσιολογική απόκριση των ατόμων στην καταπόνηση. Στα ενήλικα άτομα, δείγματα αίματος θα ληφθούν σε συγκεκριμένες χρονικές περιόδους (0.5, 1, 2, 4, 8 & 24 h) μετά την καταπόνηση για τον προσδιορισμό αιματολογικών (αιματοκρίτης, αιμοσφαιρίνη), βιοχημικών (οσμωτική πίεση, γλυκόζη, γαλακτικό οξύ, ελεύθερα λιπαρά οξέα) και ορμονικών (κορτιζόλη) δεικτών καταπόνισης. Στο γόνο θα ακολουθηθεί η ίδια μεθοδολογία μόνο που αντί για τις ανωτέρω αναλύσεις θα πραγματοποιηθεί προσδιορισμός κορτιζόλης στο σώμα του ψαριού (Karantzali et al., 2009). Ως τιμές αναφοράς θα χρησιμοποιηθούν αυτές που θα προκύψουν από άτομα (n=20, ανά αναπτυξιακή φάση) που θα έχουν συληφθεί με αγκίστρι μέσα από τη δεξαμενή (Fanouraki et al., 2007). Επίσης και στα δυο πειράματα θα γίνει συλλογή δειγμάτων νερού από κάθε δεξαμενή (χρονική στιγμή) για τον προσδιορισμό της κορτιζόλης στο νερό, ως μη επεμβατικού δείκτη καταπόνησης (Fanouraki et al., 2008).
Εργασία 4.3 Εκτίμηση του βαθμού καταπόνησης στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής
Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων της ΕΕ3, θα γίνεται δειγματοληψία σε τακτά χρονικά διαστήματα για τον προσδιορισμό των καταλληλότερων δεικτών καταπόνησης (μοριακών, βιοχημικών, ενδοκρινικών) όπως προκύψουν από τα αποτελέσματα των Εργασιών 4.1 και 4.2.
1. Ανάπτυξη νέων δεικτών εκτίμησης της καταπόνησης,
2. Διερεύνηση του μηχανισμού απόκρισης στην καταπόνηση του κρανιού,
3. Εκτίμηση του βαθμού καταπόνησης στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής,
4. Βελτιστοποίηση των συνθηκών εκτροφής για ορθή μεταχείριση (welfare) του κρανιού.
Εργασία 4.1. Ανάπτυξη νέων δεικτών εκτίμησης της καταπόνησης
Ο σκοπός αυτής της ενότητας είναι (α) η ανάπτυξη μη επεμβατικών δεικτών εκτίμησης του stress και (β) η ανάπτυξη μοριακών δεικτών εκτίμησης του χρόνιου stress. Στην κατεύθυνση αυτή θα αξιολογηθεί ο προσδιορισμός της κορτιζόλης στο νερό των δεξαμενών προπάχυνσης και μεταφοράς γόνου σαν μη επεμβατικός δείκτης εκτίμησης του stress στο συγκεκριμένο είδος. Επίσης θα αναπτυχθούν μοριακά εργαλεία για τη μελέτη της έκφρασης συγκεκριμέων γονιδίων που εμπλέκονται στον μηχανισμό χρόνιου stress, όπως HSP90, HSP70, Glucocorticoid Receptor, Mineralcorticoid Receptor.
Εργασία 4.2. Διερεύνηση του μηχανισμού καταπόνησης
Ομάδες κρανιού από δυο διαφορετικές οντογενετικές φάσεις (γόνος και ενήλικα άτομα) θα εκτεθούν σε οξύ stress (κυνήγι με απόχη μέσα στη δεξαμενή για 3-5 min και έκθεση στον αέρα για περίπου 1 min) και στη συνέχεια θα μεταφερθούν σε διαφορετικές δεξαμενές (5 άτομα/δεξαμενή) και θα μελετεθεί η φυσιολογική απόκριση των ατόμων στην καταπόνηση. Στα ενήλικα άτομα, δείγματα αίματος θα ληφθούν σε συγκεκριμένες χρονικές περιόδους (0.5, 1, 2, 4, 8 & 24 h) μετά την καταπόνηση για τον προσδιορισμό αιματολογικών (αιματοκρίτης, αιμοσφαιρίνη), βιοχημικών (οσμωτική πίεση, γλυκόζη, γαλακτικό οξύ, ελεύθερα λιπαρά οξέα) και ορμονικών (κορτιζόλη) δεικτών καταπόνισης. Στο γόνο θα ακολουθηθεί η ίδια μεθοδολογία μόνο που αντί για τις ανωτέρω αναλύσεις θα πραγματοποιηθεί προσδιορισμός κορτιζόλης στο σώμα του ψαριού (Karantzali et al., 2009). Ως τιμές αναφοράς θα χρησιμοποιηθούν αυτές που θα προκύψουν από άτομα (n=20, ανά αναπτυξιακή φάση) που θα έχουν συληφθεί με αγκίστρι μέσα από τη δεξαμενή (Fanouraki et al., 2007). Επίσης και στα δυο πειράματα θα γίνει συλλογή δειγμάτων νερού από κάθε δεξαμενή (χρονική στιγμή) για τον προσδιορισμό της κορτιζόλης στο νερό, ως μη επεμβατικού δείκτη καταπόνησης (Fanouraki et al., 2008).
Εργασία 4.3 Εκτίμηση του βαθμού καταπόνησης στις διαφορετικές συνθήκες εκτροφής
Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων της ΕΕ3, θα γίνεται δειγματοληψία σε τακτά χρονικά διαστήματα για τον προσδιορισμό των καταλληλότερων δεικτών καταπόνησης (μοριακών, βιοχημικών, ενδοκρινικών) όπως προκύψουν από τα αποτελέσματα των Εργασιών 4.1 και 4.2.