Ενότητα Εργασίας 2 - Νυμφικές εκτροφές
Στόχοι
1. Προσδιορισμός βέλτιστης μεθοδολογίας νυμφικής εκτροφής του κρανιού,
2. Μελέτη οντογένεσης σκελετού και μορφοανατομικών παραμορφώσεων,
3. Μελέτη οντογένεσης των οργάνων που συσχετίζονται με την διατροφική συμπεριφορά,
4. Μελέτη της πλαστικότητας του συκωτιού και του ματιού,
5. Προσδιορισμός διατροφικών απαιτήσεων,
6. Βιομηχανική εφαρμογή.
Εργασία 2.1. Νυμφική εκτροφή Μεσόκοσμος
Η εκτροφή με τη μεθοδολογία του Μεσόκοσμου θα αποτελέσει τη βάση για τους επόμενους πειραματισμούς καθώς τα αποτελέσματα που θα προκύψουν θεωρούνται ως βέλτιστα. Η εκτροφή θα πραγματοποιηθεί τα δύο πρώτα χρόνια υλοποίησης του έργου στις εγκαταστάσεις του ΙΥ ΕΛΚΕΘΕ, σε δεξαμενές 40μ3 με αρχική πυκνότητα 7 αυγών ανά λίτρο και θα διαρκέσει 50 ημέρες. Η μεθοδολογία που θα ακολουθηθεί (Papandroulakis et al. 2004) περιγράφεται στη συνέχεια.
Η επώαση των αυγών θα γίνει σε φυσικό θαλασσινό νερό (αλατότητα 40 psu) φιλτραρισμένο μηχανικά, ενώ το νερό για την επακόλουθη ανανέωση θα είναι από γεώτρηση (αλατότητα 32 psu, θερμοκρασία 21±1ºC). O ρυθμός ανανέωσης νερού θα αυξάνεται σταδιακά από 5% ημερησίως αρχικά σε 200% κατά τη 35 μέρα μετά την εκκόλαψη. Η παροχή αέρα στις δεξαμενές θα γίνει με τη βοήθεια ξύλινων διαχυτών. Φυτοπλαγκτόν (Chlorella minutissima, που παράγεται μαζικά σε φωτο-βιοαντιδραστήρες) θα προστίθεται καθημερινά σε συγκέντρωση 650±300 x 103 κύτταρα ml-1 για μια περίοδο 15-20 ημερών μετά από την εκκόλαψη. Συλλέκτης επιφανειακής μεμβράνης λίπους θα επιτρέψει την ανάπτυξη νηκτικής κύστης. Η φωτοφάση θα είναι 24L:0D μετά το άνοιγμα του στόματος μέχρι την ημέρα 20 μετά την εκκόλαψη και φυσική την υπόλοιπη περίοδο. Στις ιχθυονύμφες θα χορηγηθούν εμπλουτισμένα τροχόζωα, εμπλουτισμένοι ναύπλιοι Artemia Instar ΙΙ και τεχνητή τροφή. Ο εμπλουτισμός των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών θα γίνει με εμπορικά γαλακτώματα. Η συγκέντρωση των τροχοζώων και της Αrtemia στις δεξαμενές θα ρυθμίζεται 2 φορές καθημερινά σε 3-4 και σε 0.05-0.5 άτομα ml-1 αντίστοιχα.
Κατά την εκτροφή θα καταγράφονται οι περιβαλλοντικές συνθήκες στις δεξαμενές, η ανάπτυξη των ατόμων (ολικό μήκος) καθώς και η κατανάλωση τροφής. Επιπλέον από τους πληθυσμούς θα γίνει δειγματοληψία για την υλοποίηση των Εργασιών 2.4 - 2.9. Στο τέλος της νυμφικής εκτροφής οι πληθυσμοί θα συλλεχθούν, μετρηθούν και θα μεταφερθούν στις δεξαμενές προπάχυνσης.
Εργασία 2.2 Νυμφική εκτροφή σε Εντατικές συνθήκες
Η εκτροφή υπό εντατικές συνθήκες θα πραγματοποιηθεί τόσο στις εγκαταστάσεις του ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ όσο και της ΦΟΡΚΥΣ. Η γενική μεθοδολογία που θα ακολουθηθεί θα βασίζεται στην τεχνική του ψευδοπράσινου νερού (Papandroulakis et al. 2002) ενώ στο ΙΥ ΕΛΚΕΘΕ θα χρησιμοποιηθεί και αυτοματοποιημένο σύστημα ταΐσματος (Papandroulakis et al. 2002), όπως περιγράφεται στη συνέχεια.
Στις εγκαταστάσεις του ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ η εκτροφή θα γίνει σε δεξαμενές 500 l οργανωμένες σε κλειστά κυκλώματα με αρχική πυκνότητα 100 αυγών ανά λίτρο και θα διαρκέσει 50 ημέρες. Η επώαση των αυγών και η εκτροφή θα γίνει σε νερό από γεώτρηση (αλατότητα 32 psu, θερμοκρασία 21±1ºC) φιλτραρισμένο μηχανικά. O ρυθμός ανανέωσης νερού θα είναι περίπου 10% ημερησίως. Φυτοπλαγκτόν (Chlorella minutissima, που παράγεται μαζικά σε φωτο-βιοαντιδραστήρες) θα προστίθεται καθημερινά σε συγκέντρωση 650±300 x 103 κύτταρα ml-1 για μια περίοδο 15-20 ημερών μετά από την εκκόλαψη. Συλλέκτης επιφανειακής μεμβράνης λίπους θα επιτρέψει την ανάπτυξη νηκτικής κύστης. Η φωτοφάση θα είναι 24L:0D μετά το άνοιγμα του στόματος μέχρι την ημέρα 30 μετά την εκκόλαψη και φυσική την υπόλοιπη περίοδο. Η διατροφή των ιχθυονυμφών θα βασίζεται, ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες σε (α) εμπλουτισμένα τροχόζωα, (β) εμπλουτισμένους ναύπλιους Artemia Instar ΙΙ και τεχνητή τροφή. Ο εμπλουτισμός των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών θα γίνει με εμπορικά γαλακτώματα. Η χορήγηση των οργανισμών θα γίνεται με αυτοματοποιημένο σύστημα.
Στις εγκαταστάσεις της ΦΟΡΚΥΣ η εκτροφή θα γίνει σε δεξαμενές 10 m3 με ανοικτή κυκλοφορία νερού με αρχική πυκνότητα 100 αυγών ανά λίτρο και θα διαρκέσει 50 ημέρες. Η επώαση των αυγών και η εκτροφή θα γίνει σε νερό από θάλασσα (αλατότητα 37 psu, θερμοκρασία 21±1ºC) φιλτραρισμένο μηχανικά. O ρυθμός ανανέωσης νερού θα είναι περίπου 10% ημερησίως. Φυτοπλαγκτόν (Chlorella minutissima που παράγεται μαζικά) θα προστίθεται καθημερινά σε συγκέντρωση 850±300x103 κύτταρα ml-1 για μια περίοδο 15-20 ημερών μετά από την εκκόλαψη. Συλλέκτης επιφανειακής μεμβράνης λίπους θα επιτρέψει την ανάπτυξη νηκτικής κύστης. Η φωτοφάση θα είναι 24L:0D μετά το άνοιγμα του στόματος μέχρι την ημέρα 30 μετά την εκκόλαψη για το και φυσική την υπόλοιπη περίοδος. Η διατροφή των ιχθυονύμφών θα βασίζεται, ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες σε (α) εμπλουτισμένα τροχόζωα, (β) εμπλουτισμένους ναύπλιους Artemia Instar ΙΙ και τεχνητή τροφή. Ο εμπλουτισμός των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών θα γίνει με εμπορικά γαλακτώματα.
Κατά την εκτροφή θα καταγράφονται οι περιβαλλοντικές συνθήκες στις δεξαμενές, η ανάπτυξη των ατόμων (ολικό μήκος) καθώς και η κατανάλωση τροφής. Επιπλέον από τους πληθυσμούς θα γίνει δειγματοληψία για την υλοποίηση των Εργασιών 2.4 - 2.9. Στο τέλος της νυμφικής εκτροφής οι πληθυσμοί θα συλλεχθούν, μετρηθούν και θα μεταφερθούν στις δεξαμενές προπάχυνσης.
Οι εκτροφές που θα πραγματοποιηθούν έχουν σχεδιαστεί με τέτοιο τρόπο ώστε κατά το πρώτο έτος να γίνουν οι πρώτες δοκιμές των νέων μεθοδολογιών, το δεύτερο έτος να βελτιστοποιηθούν οι διαδικασίες και να γίνει η πρώτη βιομηχανικής κλίμακας δοκιμή και τέλος στο τρίτο έτος να ολοκληρωθούν τα τελικά πρωτόκολλα. Συγκεκριμένα οι εκτροφές προβλέπεται να είναι όπως παρακάτω:
Έτος 1: Μεσόκοσμος (2 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Έτος 2: Εκτροφή σε Μεσόκοσμο (2 δεξαμενές) (ΙΥ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση νέας δίαιτας (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Έτος 3: Εκτροφή σε εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση νέας δίαιτας (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εργασία 2.3 Προσδιορισμός διατροφικών απαιτήσεων/σχεδιασμός νέας δίαιτας
Κατά το πρώτο έτος θα πραγματοποιηθούν αναλύσεις χημικής σύστασης (ολική πρωτεΐνη, ολικά λίπη, ανόργανες ουσίες, υγρασία, αμινοξέα, λιπαρά οξέα) δειγμάτων από αβγά, λεκιθοφόρες προνύμφες της 2-3ης μέρας και ιχθυονύμφες της 25ης ημέρας μετά την εκκόλαψη από τις τρεις εκτροφές α. Μεσόκοσμος, β. εκτροφή με Artemia και γ. εκτροφή χωρίς Artemia. Η χημική ανάλυση θα περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης, λίπους, υγρασίας, ανόργανων ουσιών σύμφωνα με το AOAC (Association of Official Analytical Chemists , 1998). Επίσης, θα πραγματοποιηθούν αναλύσεις της σύστασής τους σε αμινοξέα (Kotzamanis et al., 2008) με τη χρήση υγρού χρωματογράφου υπερ-υψηλής απόδοσης (UPLC, Waters) και λιπαρών οξέων με αέρια χρωματογραφία (Moraiti-Ioannidou et al., 2007).
Τα αποτελέσματα αυτά θα χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό και την παραγωγή τεχνητής ξηρής τροφής που θα παραχθεί στο εργαστήριο μετά τη μηχανική άλεση, το κοσκίνισμα και την ανάμιξη όλων των πρώτων υλών που θα χρησιμοποιηθούν. Το μέγεθος του κόκκου τη τροφής θα είναι μικρότερο των 500 μm για να μπορεί να προσληφθεί από την ιχθυονύμφη.
Πειραματική εκτροφή σε εντατικές συνθήκες στο ΙΥ (Εργασία 2.2) θα επιτρέψει την αξιολόγηση της νέας τεχνητής τροφής. Η εκτίμηση της ωρίμανσης του πεπτικού συστήματος των ιχθυονυμφών θα γίνει μετρώντας την ενεργότητα της θρυψίνης και της αμυλάσης, καθώς και της αμινοπεπτιδάσης και της αλκαλικής φωσφατάσης. Η μέτρηση της ενεργότητας των ενζύμων αυτών θα γίνει συγκριτικά για ιχθυονύμφες στις οποίες χορηγήθηκε τεχνητή τροφή και ατόμων από την παράλληλη εκτροφή στον Μεσόκοσμο. Οι αναλύσεις της ενεργότητας των πεπτικών ενζύμων θρυψίνης, αμυλάσης και αμινοπεπτιδάσης, αλκαλικής φωσφατάσης θα γίνουν σε δείγματα 100 -150 ιχθυονυμφών μετά την ανατομική κοπή και διάκριση των τμημάτων του σώματός τους που φέρουν τον παγκρεατικό αδένα και τον εντερικό σωλήνα με την βοήθεια στερεοσκοπίου και σύμφωνα με τους Kotzamanis et al. (2007).
Εργασία 2.4. Μελέτη οντογένεσης του σκελετού
Από την εκκόλαψη των αυγών και καθόλη τη διάρκεια της νυμφικής εκτροφής θα λαμβάνονται δείγματα τουλάχιστον 20 ατόμων κάθε δεύτερη ημέρα. Τα άτομα θα συντηρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5% και θα αποθηκεύονται στο σκοτάδι. Η επεξεργασία των δειγμάτων αυτών θα γίνει από το ΠΚ μέσω διπλής χρώσης με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας ούτως ώστε να γίνει εφικτή η παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Θα πραγματοποιηθεί η μελέτη της οντογένεσης του σκελετού σε έναν πληθυσμό από κάθε μια από τις τρεις συνθήκες εκτροφής που θα πραγματοποιηθούν από το ΕΛΚΕΘΕ (κλασσική εντατική μέθοδος, τροποποιημένη εντατική μέθοδος και Μεσόκοσμος) και θα καταγραφεί τυχόν διαφοροποίηση στην ταχύτητα ανάπτυξης αυτού.
Εργασία 2.5. Μελέτη μορφοανατομικών παραμορφώσεων
Η εμφάνιση ή όχι παραμορφώσεων στους εκτρεφόμενους υπό διαφορετικές συνθήκες ιχθύες θα μελετηθεί από το ΠΚ σε δείγματα (100 ατόμων ανά μέθοδο εκτροφής) που θα ληφθούν τυχαία α) στο στάδιο της κάμψης της νωτοχορδής και β) στο τέλος της νυμφικής εκτροφής και θα συντηρηθούν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%. Για τη μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων θα ακολουθήσει διπλή χρώση των νυμφικών δειγμάτων με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας και παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Επίσης, χρησιμοποιώντας τα δείγματα της Εργασίας 2.1. θα είναι εφικτή η ανάδρομη μελέτη του σταδίου όπου οι σκελετικές παραμορφώσεις αναπτύσσονται.
Εργασία 2.6. Μελέτη οντογένεσης των οργάνων που συσχετίζονται με την διατροφική συμπεριφορά.
Δείγματα 10 ατόμων κατά τις ημέρες εκτροφής όπως φαίνονται παρακάτω -0 (μια μέρα πριν την εκκόλαψη), 0 (την ημέρα εκκόλαψης) την 1η, 2η, 3η, 4η, 5η, 6η, 7η, 8η, 9η, 11η, 13η, 15η, 17η, 20η, 23η, 26η, 30η, 34η, 38η, 44η, 48η, θα ληφθούν σε συγκεκριμένη χρονική στιγμή της ημέρας και θα διατηρηθούν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης και γλουταραλδεΰδης (4F:1G). Στην συνέχεια αφού υποστούν μια σειρά από αφυδατώσεις με αιθανόλη θα μονιμοποιηθούν και στην συνέχεια θα γίνει μικροτόμηση των δειγμάτων με χρήση μικροτόμου. Η μικροτόμος θα ρυθμιστεί ανάλογα με την τομή και τον τύπο του ιστού στα 3-4-5 μm. Οι τομές των δειγμάτων αφού τοποθετηθούν στη επιφάνεια ύδατος θερμοκρασία 25-30 0C θα συλλεχθούν με γυάλινες αντικειμενοφόρους. Αφού παραμείνουν για χρονικό διάστημα 24 ωρών για να στεγνώσουν θα ξεκινήσει η διεργασία της χρώσης. Η χρώση των δειγμάτων θα γίνει χρησιμοποιώντας Polychrome I (Methylene blue-Azzure II) και Polychrome II (Basic Fuchsin). Στην συνέχεια με χρήση μικροσκοπίου και στερεοσκοπίου θα γίνει παρατήρηση των τομών και θα σημειωθεί η μέρα εμφάνισης κάθε δομής σε κάθε όργανο.
Οντογένεση Πεπτικού συστήματος.
Θα προσδιοριστούν χρονικά (ποτέ εμφανίζονται) και θα χαρτογραφηθούν (που εμφανίζονται) πάνω στο πεπτικό σύστημα κύριες δομές που το αποτελούν στο παρόν σύστημα, και λόγω θέσης θα μελετηθεί και η εμφάνιση του συστήματος της γεύσης.
Οντογένεση ματιού.
Θα προσδιοριστούν χρονικά και θα χαρτογραφηθούν πάνω στον αμφιβληστροειδή οι κύριες δομές που το αποτελούν.
Οντογένεση συστήματος όσφρησης.
Θα προσδιοριστούν χρονικά και θα χαρτογραφηθούν πάνω στο σύστημα της όσφρησης οι κυρίες δομές που το αποτελούν.
Εργασία 2.7. Μελέτη της πλαστικότητας του συκωτιού.
Για την πλαστικότητα των οργάνων του συκωτιού μια σειρά από φωτογραφίες σε κάθε ημέρα εκτροφής θα παρθούν από 3-4 άτομα για κάθε ημέρα δειγματοληψίας. Οι φωτογραφίες θα αναφέρονται σε κάθε δομή ξεχωριστά. Από κάθε νύμφη 6 διαφορετικές περιοχές του συκωτιού θα φωτογραφηθούν σε μεγέθυνση Χ100. Στην συνέχεια με σύστημα ανάλυσης εικόνας θα υπολογιστεί με ακρίβεια το ποσοστό κάλυψης με λίπος στο συκώτι των ψαριών και θα παρουσιασθεί ως ποσοστό κάλυψης της μετρήσιμης επιφάνειας της φωτογραφίας. Από κάθε φωτογραφία που θα μελετηθεί, θα μετρηθεί η εναπόθεση λίπους στο συκώτι και η διάμετρος του πυρήνα των ηπατοκυττάρων.
Εργασία 2.8. Μελέτη της πλαστικότητας του ματιού.
Για την πλαστικότητα του ματιού οι διάφορες τομές, 4 ανά ψάρι για 3 ψάρια από κάθε ημέρα δειγματοληψίας, θα παρθούν από τον αμφιβληστροειδή και θα φωτογραφηθούν σε μεγέθυνση Χ100. Στην συνέχεια με την βοήθεια συστήματος ανάλυσης εικόνας οι φωτογραφίες αφού θα τροποποιηθούν κατάλλληλα ώστε οι διάφορες δομές να γίνουν περισσότερο ορατές, θα γίνει ανάλυση εικόνας με στόχο τον προσδιορισμό α) του αριθμού των ραβδίων και των κωνίων που υπάρχουν στον αμφιβληστροειδή, β) της ιστολογικής οπτικής οξύτητας (θεωρητική οξύτητα) του είδους, γεγονός το οποίο πρόκειται να μας δώσει πληροφορίες για το μέγεθος της τροφής και την απόσταση στην οποία το ψάρι την αντιλαμβάνεται.
Εργασία 2.9. Μελέτη οντογένεσης πεπτικών ενζύμων.
Δείγματα ατόμων από την εκτροφή σε Μεσόκοσμο (Ε 2.1) θα χρησιμοποιηθούν για να προσδιοριστούν τα πεπτικά ένζυμα στα ακόλουθα αναπτυξιακά στάδια: (α) εκκόλαψη, (β) άνοιγμα στόματος, (γ) απορρόφηση σταγόνας λιπιδίων, (δ) κάμψη νωτοχορδής (flexion), (ε) κάλυψη του σώματος με μελανοφόρα, (στ) ολοκλήρωση σχηματισμού πτερυγίων. Θα μετρηθεί η ενεργότητα πεψίνης, θρυψίνης, και καρβοξυπεπτιδάσων, α-αμυλάσης, λιπάσης και φωσφολιπάσης, αμινοπεπτιδάσης και αλκαλικής φωσφατάσης. Για τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας ενζύμων που μετέχουν στο μεταβολισμό πρωτεϊνών και υδαταθράνκων θα χρησιμοποιηθούν φωτομετρικές μέθοδοι χρησιμοποιώντας κατάλληλα ενζυμικά υποστρώματα, ενώ για τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας της ολικής λιπολυτικής δραστικότητας θα χρησιμοποιηθεί ποτενσιομετρική μέθοδος χρησιμοποιώντας σαν υπόστρωμα ελαιόλαδο (Worthington 1993, Boehringer Mannheim 1975, Schaller and Triebig, 1994, Choi and Szoka, 2000). Ταξινόμηση των πρωτεολυτικών ενζύμων θα πραγματοποιηθεί κινητικά χρησιμοποιώντας εκλεκτικούς ενζυμικούς αναστολείς. Ηλεκτροφορητική ταξινόμηση αμυλολυτικών, λιπολυτικών και πρωτεολυτικών ενζύμων θα πραγματοποιηθεί με εφαρμογή SDS-PAGE παρουσία κατάλληλων υποστρωμάτων και εκλεκτικής χρώσης (Lantz and Ciborowski 1994, Yadav et al. 1998). Τα ζυμογράμματα που θα αναπτυχθούν και θα συνεκτιμηθούν λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της προηγούμενης μελέτης.
1. Προσδιορισμός βέλτιστης μεθοδολογίας νυμφικής εκτροφής του κρανιού,
2. Μελέτη οντογένεσης σκελετού και μορφοανατομικών παραμορφώσεων,
3. Μελέτη οντογένεσης των οργάνων που συσχετίζονται με την διατροφική συμπεριφορά,
4. Μελέτη της πλαστικότητας του συκωτιού και του ματιού,
5. Προσδιορισμός διατροφικών απαιτήσεων,
6. Βιομηχανική εφαρμογή.
Εργασία 2.1. Νυμφική εκτροφή Μεσόκοσμος
Η εκτροφή με τη μεθοδολογία του Μεσόκοσμου θα αποτελέσει τη βάση για τους επόμενους πειραματισμούς καθώς τα αποτελέσματα που θα προκύψουν θεωρούνται ως βέλτιστα. Η εκτροφή θα πραγματοποιηθεί τα δύο πρώτα χρόνια υλοποίησης του έργου στις εγκαταστάσεις του ΙΥ ΕΛΚΕΘΕ, σε δεξαμενές 40μ3 με αρχική πυκνότητα 7 αυγών ανά λίτρο και θα διαρκέσει 50 ημέρες. Η μεθοδολογία που θα ακολουθηθεί (Papandroulakis et al. 2004) περιγράφεται στη συνέχεια.
Η επώαση των αυγών θα γίνει σε φυσικό θαλασσινό νερό (αλατότητα 40 psu) φιλτραρισμένο μηχανικά, ενώ το νερό για την επακόλουθη ανανέωση θα είναι από γεώτρηση (αλατότητα 32 psu, θερμοκρασία 21±1ºC). O ρυθμός ανανέωσης νερού θα αυξάνεται σταδιακά από 5% ημερησίως αρχικά σε 200% κατά τη 35 μέρα μετά την εκκόλαψη. Η παροχή αέρα στις δεξαμενές θα γίνει με τη βοήθεια ξύλινων διαχυτών. Φυτοπλαγκτόν (Chlorella minutissima, που παράγεται μαζικά σε φωτο-βιοαντιδραστήρες) θα προστίθεται καθημερινά σε συγκέντρωση 650±300 x 103 κύτταρα ml-1 για μια περίοδο 15-20 ημερών μετά από την εκκόλαψη. Συλλέκτης επιφανειακής μεμβράνης λίπους θα επιτρέψει την ανάπτυξη νηκτικής κύστης. Η φωτοφάση θα είναι 24L:0D μετά το άνοιγμα του στόματος μέχρι την ημέρα 20 μετά την εκκόλαψη και φυσική την υπόλοιπη περίοδο. Στις ιχθυονύμφες θα χορηγηθούν εμπλουτισμένα τροχόζωα, εμπλουτισμένοι ναύπλιοι Artemia Instar ΙΙ και τεχνητή τροφή. Ο εμπλουτισμός των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών θα γίνει με εμπορικά γαλακτώματα. Η συγκέντρωση των τροχοζώων και της Αrtemia στις δεξαμενές θα ρυθμίζεται 2 φορές καθημερινά σε 3-4 και σε 0.05-0.5 άτομα ml-1 αντίστοιχα.
Κατά την εκτροφή θα καταγράφονται οι περιβαλλοντικές συνθήκες στις δεξαμενές, η ανάπτυξη των ατόμων (ολικό μήκος) καθώς και η κατανάλωση τροφής. Επιπλέον από τους πληθυσμούς θα γίνει δειγματοληψία για την υλοποίηση των Εργασιών 2.4 - 2.9. Στο τέλος της νυμφικής εκτροφής οι πληθυσμοί θα συλλεχθούν, μετρηθούν και θα μεταφερθούν στις δεξαμενές προπάχυνσης.
Εργασία 2.2 Νυμφική εκτροφή σε Εντατικές συνθήκες
Η εκτροφή υπό εντατικές συνθήκες θα πραγματοποιηθεί τόσο στις εγκαταστάσεις του ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ όσο και της ΦΟΡΚΥΣ. Η γενική μεθοδολογία που θα ακολουθηθεί θα βασίζεται στην τεχνική του ψευδοπράσινου νερού (Papandroulakis et al. 2002) ενώ στο ΙΥ ΕΛΚΕΘΕ θα χρησιμοποιηθεί και αυτοματοποιημένο σύστημα ταΐσματος (Papandroulakis et al. 2002), όπως περιγράφεται στη συνέχεια.
Στις εγκαταστάσεις του ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ η εκτροφή θα γίνει σε δεξαμενές 500 l οργανωμένες σε κλειστά κυκλώματα με αρχική πυκνότητα 100 αυγών ανά λίτρο και θα διαρκέσει 50 ημέρες. Η επώαση των αυγών και η εκτροφή θα γίνει σε νερό από γεώτρηση (αλατότητα 32 psu, θερμοκρασία 21±1ºC) φιλτραρισμένο μηχανικά. O ρυθμός ανανέωσης νερού θα είναι περίπου 10% ημερησίως. Φυτοπλαγκτόν (Chlorella minutissima, που παράγεται μαζικά σε φωτο-βιοαντιδραστήρες) θα προστίθεται καθημερινά σε συγκέντρωση 650±300 x 103 κύτταρα ml-1 για μια περίοδο 15-20 ημερών μετά από την εκκόλαψη. Συλλέκτης επιφανειακής μεμβράνης λίπους θα επιτρέψει την ανάπτυξη νηκτικής κύστης. Η φωτοφάση θα είναι 24L:0D μετά το άνοιγμα του στόματος μέχρι την ημέρα 30 μετά την εκκόλαψη και φυσική την υπόλοιπη περίοδο. Η διατροφή των ιχθυονυμφών θα βασίζεται, ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες σε (α) εμπλουτισμένα τροχόζωα, (β) εμπλουτισμένους ναύπλιους Artemia Instar ΙΙ και τεχνητή τροφή. Ο εμπλουτισμός των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών θα γίνει με εμπορικά γαλακτώματα. Η χορήγηση των οργανισμών θα γίνεται με αυτοματοποιημένο σύστημα.
Στις εγκαταστάσεις της ΦΟΡΚΥΣ η εκτροφή θα γίνει σε δεξαμενές 10 m3 με ανοικτή κυκλοφορία νερού με αρχική πυκνότητα 100 αυγών ανά λίτρο και θα διαρκέσει 50 ημέρες. Η επώαση των αυγών και η εκτροφή θα γίνει σε νερό από θάλασσα (αλατότητα 37 psu, θερμοκρασία 21±1ºC) φιλτραρισμένο μηχανικά. O ρυθμός ανανέωσης νερού θα είναι περίπου 10% ημερησίως. Φυτοπλαγκτόν (Chlorella minutissima που παράγεται μαζικά) θα προστίθεται καθημερινά σε συγκέντρωση 850±300x103 κύτταρα ml-1 για μια περίοδο 15-20 ημερών μετά από την εκκόλαψη. Συλλέκτης επιφανειακής μεμβράνης λίπους θα επιτρέψει την ανάπτυξη νηκτικής κύστης. Η φωτοφάση θα είναι 24L:0D μετά το άνοιγμα του στόματος μέχρι την ημέρα 30 μετά την εκκόλαψη για το και φυσική την υπόλοιπη περίοδος. Η διατροφή των ιχθυονύμφών θα βασίζεται, ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες σε (α) εμπλουτισμένα τροχόζωα, (β) εμπλουτισμένους ναύπλιους Artemia Instar ΙΙ και τεχνητή τροφή. Ο εμπλουτισμός των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών θα γίνει με εμπορικά γαλακτώματα.
Κατά την εκτροφή θα καταγράφονται οι περιβαλλοντικές συνθήκες στις δεξαμενές, η ανάπτυξη των ατόμων (ολικό μήκος) καθώς και η κατανάλωση τροφής. Επιπλέον από τους πληθυσμούς θα γίνει δειγματοληψία για την υλοποίηση των Εργασιών 2.4 - 2.9. Στο τέλος της νυμφικής εκτροφής οι πληθυσμοί θα συλλεχθούν, μετρηθούν και θα μεταφερθούν στις δεξαμενές προπάχυνσης.
Οι εκτροφές που θα πραγματοποιηθούν έχουν σχεδιαστεί με τέτοιο τρόπο ώστε κατά το πρώτο έτος να γίνουν οι πρώτες δοκιμές των νέων μεθοδολογιών, το δεύτερο έτος να βελτιστοποιηθούν οι διαδικασίες και να γίνει η πρώτη βιομηχανικής κλίμακας δοκιμή και τέλος στο τρίτο έτος να ολοκληρωθούν τα τελικά πρωτόκολλα. Συγκεκριμένα οι εκτροφές προβλέπεται να είναι όπως παρακάτω:
Έτος 1: Μεσόκοσμος (2 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Έτος 2: Εκτροφή σε Μεσόκοσμο (2 δεξαμενές) (ΙΥ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση νέας δίαιτας (3 δεξαμενές) (ΙΥ-ΕΛΚΕΘΕ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Έτος 3: Εκτροφή σε εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων και Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση τροχοζώων χωρίς Αρτέμια (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εντατικές συνθήκες με χρήση νέας δίαιτας (3 δεξαμενές) (ΦΟΡΚΥΣ)
Εργασία 2.3 Προσδιορισμός διατροφικών απαιτήσεων/σχεδιασμός νέας δίαιτας
Κατά το πρώτο έτος θα πραγματοποιηθούν αναλύσεις χημικής σύστασης (ολική πρωτεΐνη, ολικά λίπη, ανόργανες ουσίες, υγρασία, αμινοξέα, λιπαρά οξέα) δειγμάτων από αβγά, λεκιθοφόρες προνύμφες της 2-3ης μέρας και ιχθυονύμφες της 25ης ημέρας μετά την εκκόλαψη από τις τρεις εκτροφές α. Μεσόκοσμος, β. εκτροφή με Artemia και γ. εκτροφή χωρίς Artemia. Η χημική ανάλυση θα περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης, λίπους, υγρασίας, ανόργανων ουσιών σύμφωνα με το AOAC (Association of Official Analytical Chemists , 1998). Επίσης, θα πραγματοποιηθούν αναλύσεις της σύστασής τους σε αμινοξέα (Kotzamanis et al., 2008) με τη χρήση υγρού χρωματογράφου υπερ-υψηλής απόδοσης (UPLC, Waters) και λιπαρών οξέων με αέρια χρωματογραφία (Moraiti-Ioannidou et al., 2007).
Τα αποτελέσματα αυτά θα χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό και την παραγωγή τεχνητής ξηρής τροφής που θα παραχθεί στο εργαστήριο μετά τη μηχανική άλεση, το κοσκίνισμα και την ανάμιξη όλων των πρώτων υλών που θα χρησιμοποιηθούν. Το μέγεθος του κόκκου τη τροφής θα είναι μικρότερο των 500 μm για να μπορεί να προσληφθεί από την ιχθυονύμφη.
Πειραματική εκτροφή σε εντατικές συνθήκες στο ΙΥ (Εργασία 2.2) θα επιτρέψει την αξιολόγηση της νέας τεχνητής τροφής. Η εκτίμηση της ωρίμανσης του πεπτικού συστήματος των ιχθυονυμφών θα γίνει μετρώντας την ενεργότητα της θρυψίνης και της αμυλάσης, καθώς και της αμινοπεπτιδάσης και της αλκαλικής φωσφατάσης. Η μέτρηση της ενεργότητας των ενζύμων αυτών θα γίνει συγκριτικά για ιχθυονύμφες στις οποίες χορηγήθηκε τεχνητή τροφή και ατόμων από την παράλληλη εκτροφή στον Μεσόκοσμο. Οι αναλύσεις της ενεργότητας των πεπτικών ενζύμων θρυψίνης, αμυλάσης και αμινοπεπτιδάσης, αλκαλικής φωσφατάσης θα γίνουν σε δείγματα 100 -150 ιχθυονυμφών μετά την ανατομική κοπή και διάκριση των τμημάτων του σώματός τους που φέρουν τον παγκρεατικό αδένα και τον εντερικό σωλήνα με την βοήθεια στερεοσκοπίου και σύμφωνα με τους Kotzamanis et al. (2007).
Εργασία 2.4. Μελέτη οντογένεσης του σκελετού
Από την εκκόλαψη των αυγών και καθόλη τη διάρκεια της νυμφικής εκτροφής θα λαμβάνονται δείγματα τουλάχιστον 20 ατόμων κάθε δεύτερη ημέρα. Τα άτομα θα συντηρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5% και θα αποθηκεύονται στο σκοτάδι. Η επεξεργασία των δειγμάτων αυτών θα γίνει από το ΠΚ μέσω διπλής χρώσης με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας ούτως ώστε να γίνει εφικτή η παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Θα πραγματοποιηθεί η μελέτη της οντογένεσης του σκελετού σε έναν πληθυσμό από κάθε μια από τις τρεις συνθήκες εκτροφής που θα πραγματοποιηθούν από το ΕΛΚΕΘΕ (κλασσική εντατική μέθοδος, τροποποιημένη εντατική μέθοδος και Μεσόκοσμος) και θα καταγραφεί τυχόν διαφοροποίηση στην ταχύτητα ανάπτυξης αυτού.
Εργασία 2.5. Μελέτη μορφοανατομικών παραμορφώσεων
Η εμφάνιση ή όχι παραμορφώσεων στους εκτρεφόμενους υπό διαφορετικές συνθήκες ιχθύες θα μελετηθεί από το ΠΚ σε δείγματα (100 ατόμων ανά μέθοδο εκτροφής) που θα ληφθούν τυχαία α) στο στάδιο της κάμψης της νωτοχορδής και β) στο τέλος της νυμφικής εκτροφής και θα συντηρηθούν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%. Για τη μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων θα ακολουθήσει διπλή χρώση των νυμφικών δειγμάτων με Αλιζαρίνη και Κυανό της Αλσατίας και παρατήρηση του σκελετού σε στερεοσκόπιο (Olympus SZX-9). Επίσης, χρησιμοποιώντας τα δείγματα της Εργασίας 2.1. θα είναι εφικτή η ανάδρομη μελέτη του σταδίου όπου οι σκελετικές παραμορφώσεις αναπτύσσονται.
Εργασία 2.6. Μελέτη οντογένεσης των οργάνων που συσχετίζονται με την διατροφική συμπεριφορά.
Δείγματα 10 ατόμων κατά τις ημέρες εκτροφής όπως φαίνονται παρακάτω -0 (μια μέρα πριν την εκκόλαψη), 0 (την ημέρα εκκόλαψης) την 1η, 2η, 3η, 4η, 5η, 6η, 7η, 8η, 9η, 11η, 13η, 15η, 17η, 20η, 23η, 26η, 30η, 34η, 38η, 44η, 48η, θα ληφθούν σε συγκεκριμένη χρονική στιγμή της ημέρας και θα διατηρηθούν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης και γλουταραλδεΰδης (4F:1G). Στην συνέχεια αφού υποστούν μια σειρά από αφυδατώσεις με αιθανόλη θα μονιμοποιηθούν και στην συνέχεια θα γίνει μικροτόμηση των δειγμάτων με χρήση μικροτόμου. Η μικροτόμος θα ρυθμιστεί ανάλογα με την τομή και τον τύπο του ιστού στα 3-4-5 μm. Οι τομές των δειγμάτων αφού τοποθετηθούν στη επιφάνεια ύδατος θερμοκρασία 25-30 0C θα συλλεχθούν με γυάλινες αντικειμενοφόρους. Αφού παραμείνουν για χρονικό διάστημα 24 ωρών για να στεγνώσουν θα ξεκινήσει η διεργασία της χρώσης. Η χρώση των δειγμάτων θα γίνει χρησιμοποιώντας Polychrome I (Methylene blue-Azzure II) και Polychrome II (Basic Fuchsin). Στην συνέχεια με χρήση μικροσκοπίου και στερεοσκοπίου θα γίνει παρατήρηση των τομών και θα σημειωθεί η μέρα εμφάνισης κάθε δομής σε κάθε όργανο.
Οντογένεση Πεπτικού συστήματος.
Θα προσδιοριστούν χρονικά (ποτέ εμφανίζονται) και θα χαρτογραφηθούν (που εμφανίζονται) πάνω στο πεπτικό σύστημα κύριες δομές που το αποτελούν στο παρόν σύστημα, και λόγω θέσης θα μελετηθεί και η εμφάνιση του συστήματος της γεύσης.
Οντογένεση ματιού.
Θα προσδιοριστούν χρονικά και θα χαρτογραφηθούν πάνω στον αμφιβληστροειδή οι κύριες δομές που το αποτελούν.
Οντογένεση συστήματος όσφρησης.
Θα προσδιοριστούν χρονικά και θα χαρτογραφηθούν πάνω στο σύστημα της όσφρησης οι κυρίες δομές που το αποτελούν.
Εργασία 2.7. Μελέτη της πλαστικότητας του συκωτιού.
Για την πλαστικότητα των οργάνων του συκωτιού μια σειρά από φωτογραφίες σε κάθε ημέρα εκτροφής θα παρθούν από 3-4 άτομα για κάθε ημέρα δειγματοληψίας. Οι φωτογραφίες θα αναφέρονται σε κάθε δομή ξεχωριστά. Από κάθε νύμφη 6 διαφορετικές περιοχές του συκωτιού θα φωτογραφηθούν σε μεγέθυνση Χ100. Στην συνέχεια με σύστημα ανάλυσης εικόνας θα υπολογιστεί με ακρίβεια το ποσοστό κάλυψης με λίπος στο συκώτι των ψαριών και θα παρουσιασθεί ως ποσοστό κάλυψης της μετρήσιμης επιφάνειας της φωτογραφίας. Από κάθε φωτογραφία που θα μελετηθεί, θα μετρηθεί η εναπόθεση λίπους στο συκώτι και η διάμετρος του πυρήνα των ηπατοκυττάρων.
Εργασία 2.8. Μελέτη της πλαστικότητας του ματιού.
Για την πλαστικότητα του ματιού οι διάφορες τομές, 4 ανά ψάρι για 3 ψάρια από κάθε ημέρα δειγματοληψίας, θα παρθούν από τον αμφιβληστροειδή και θα φωτογραφηθούν σε μεγέθυνση Χ100. Στην συνέχεια με την βοήθεια συστήματος ανάλυσης εικόνας οι φωτογραφίες αφού θα τροποποιηθούν κατάλλληλα ώστε οι διάφορες δομές να γίνουν περισσότερο ορατές, θα γίνει ανάλυση εικόνας με στόχο τον προσδιορισμό α) του αριθμού των ραβδίων και των κωνίων που υπάρχουν στον αμφιβληστροειδή, β) της ιστολογικής οπτικής οξύτητας (θεωρητική οξύτητα) του είδους, γεγονός το οποίο πρόκειται να μας δώσει πληροφορίες για το μέγεθος της τροφής και την απόσταση στην οποία το ψάρι την αντιλαμβάνεται.
Εργασία 2.9. Μελέτη οντογένεσης πεπτικών ενζύμων.
Δείγματα ατόμων από την εκτροφή σε Μεσόκοσμο (Ε 2.1) θα χρησιμοποιηθούν για να προσδιοριστούν τα πεπτικά ένζυμα στα ακόλουθα αναπτυξιακά στάδια: (α) εκκόλαψη, (β) άνοιγμα στόματος, (γ) απορρόφηση σταγόνας λιπιδίων, (δ) κάμψη νωτοχορδής (flexion), (ε) κάλυψη του σώματος με μελανοφόρα, (στ) ολοκλήρωση σχηματισμού πτερυγίων. Θα μετρηθεί η ενεργότητα πεψίνης, θρυψίνης, και καρβοξυπεπτιδάσων, α-αμυλάσης, λιπάσης και φωσφολιπάσης, αμινοπεπτιδάσης και αλκαλικής φωσφατάσης. Για τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας ενζύμων που μετέχουν στο μεταβολισμό πρωτεϊνών και υδαταθράνκων θα χρησιμοποιηθούν φωτομετρικές μέθοδοι χρησιμοποιώντας κατάλληλα ενζυμικά υποστρώματα, ενώ για τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας της ολικής λιπολυτικής δραστικότητας θα χρησιμοποιηθεί ποτενσιομετρική μέθοδος χρησιμοποιώντας σαν υπόστρωμα ελαιόλαδο (Worthington 1993, Boehringer Mannheim 1975, Schaller and Triebig, 1994, Choi and Szoka, 2000). Ταξινόμηση των πρωτεολυτικών ενζύμων θα πραγματοποιηθεί κινητικά χρησιμοποιώντας εκλεκτικούς ενζυμικούς αναστολείς. Ηλεκτροφορητική ταξινόμηση αμυλολυτικών, λιπολυτικών και πρωτεολυτικών ενζύμων θα πραγματοποιηθεί με εφαρμογή SDS-PAGE παρουσία κατάλληλων υποστρωμάτων και εκλεκτικής χρώσης (Lantz and Ciborowski 1994, Yadav et al. 1998). Τα ζυμογράμματα που θα αναπτυχθούν και θα συνεκτιμηθούν λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της προηγούμενης μελέτης.